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| 08.10.2009 | |||
| 16:00 | MFK Karviná | 1-1/p.5-4 | 1. FC Brno |
| 16:00 | Nachod-Destne | 0-6 | Sparta Praha |
| 16:00 | Slavia Karlovy Vary | 1-1/p.4-5 | Slavia Praha |
| 29.09.2009 | |||
| 16:30 | Sokol Zivanice | 1-0 | Vítkovice |
| 23.09.2009 | |||
| 16:30 | FC Pisek | 1-1/p.1-4 | FK Jablonec |
| 16:30 | Fotbal Trinec | 0-1 | Bohemians 1905 |
| 16:30 | HFK Trebic | 0-1 | Znojmo |
| 16:30 | Hlucin | 1-3 | FK Teplice |
| 16:30 | Hradec Kralove | 2-1 | Bohemians Praha |
| 16:30 | MSK Breclav | 0-1 | SK Kladno |
| 16:30 | Slovan Varnsdorf | 0-1 | Pribram |
| 16:30 | Sokol Protivanov | 0-5 | Sigma Olomouc |
| 16:30 | Viktoria Zizkov | 0-1 | Ceske Budejovice |
| 22.09.2009 | |||
| 16:30 | Dukla Praha | 1-4 | Viktoria Plzen |
| 16:00 | FK Zlin | 1-1/p.1-3 | Slovan Liberec |
| 16.09.2009 | |||
| 18:00 | Opava | 1-1/p.3-4 | Banik Ostrava |