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| 29.08.2009 | |||
| 19:30 | Achilles '29 | 2-1 | Berkum |
| 19:30 | ACV Assen | 0-2 AET | AFC Amsterdam |
| 19:30 | AFC '34 Alkmaar | 2-1 | Zaamslag |
| 19:30 | Capelle | 2-0 | VV UNA |
| 19:30 | De Treffers | 2-1 | Go-Ahead Kampen |
| 19:30 | DOVO | 0-2 | Haaglandia VV |
| 19:30 | Drachtster Boys | 0-2 | SC Joure |
| 19:30 | EVV Echt | 0-4 | BVV Barendrecht |
| 19:30 | Excelsior Maassluis | 1-0 | Rood Wit '62 |
| 19:30 | FC Chabab | 1-2 | WHC Wezep |
| 19:30 | FC Hilversum | 2-5 | SV Argon |
| 19:30 | Groene Ster | 2-4 | Harkemase Boys |
| 19:30 | GVVV | 1-0 | WKE |
| 19:30 | HBS-Craeyenhout | 0-2 | Bennekom |
| 19:30 | HHC Hardenberg | 1-2 | FC Lisse |
| 19:30 | HSV Hoek | 0-1 AET | Gemert |
| 19:30 | IJsselmeervogels | 3-0 | HSC '21 |
| 19:30 | JVC Cuijk | 1-1/p.3-5 | ASWH |
| 19:30 | LRC Leerdam | 4-2 | Quick 1920 |
| 19:30 | Rijnsburgse Boys | 3-0 | SV Argon |
| 19:30 | RKVV Westlandia | 2-0 | Nunspeet |
| 19:30 | VV Baronie | 3-0 | Kloetinge |
| 19:30 | VV Schaesberg | 1-3 | Sparta Nijkerk |
| 19:30 | Waspik | 0-2 | SDC Putten |